Referat HERSTELLUNG DER ENZYME - Etwas aus der Geschichte der Enzymanwendung, Mikrobielle Erzeugung der Enzyme, Enzym-Aufarbeitung

HERSTELLUNG DER ENZYME

Etwas aus der Geschichte der Enzymanwendung

Die Anwendung von Enzymen und Mikroorganismen zur Verarbeitung von pflanzlichen und tierischen Rohstoffen ist eine seit langem geübte Technik. Früher standen die Verfahren mit lebenden Mikroorganismen im Vordergrund. Diese traditionellen Prozesse, wie die Herstellung von alkoholischen Getränken und die Hefe-Fermentation von Teig bei der Brotherstellung, wurden bereits auf ägyptischen Wandbildern dargestellt. Auch die Verfahren zur Haltbarmachung von Lebensmitteln, wie die Konservierung von Gemüse durch Fermentation mit Lactobazillen (Sauerkraut) oder die Herstellung von Käse zur Konservierung von Milchprodukten, gehören hierzu.

Mikrobielle Erzeugung der Enzyme

Für die Leichtindustrie und die Landwirtschaft werden in der Mehrzahl der Fälle technische Enzyme verlangt, für die Lebensmittelindustrie jedoch gereinigte.

Als Enzymproduzenten werden Bakterien, Pilze, Hefen und Aktinomyzeten verwendet.

Eine industrieele Produktion mikrobiell erzeugter Enzyme ist nur bei Einsatz von Hochleistungsstämmen effektiv.

Durch die in den letzten Jahren durchgeführten Untersuchungen zur Isolierung und Selektion (Gentechnologie) von enzymproduzierenden Mikroorganismen wurde die Produktivität der industriell eingesetzten Stämme erheblich gesteigert.

Der Herstellungsprozeß mikrobieller Enzympräparate ist außerordentlich kompliziert und besteht aus einer Vielzahl technologischer Operationen. Die ersten Stufen dienen dem Wachstum von Enzymproduzenten und beinhaltet folgende Teilschritte: Gewinnung des Impfmaterials, Zubereitung und Sterilisation der Nährmedien, Beimpfung der Nährmedien für die Produktion sowie Fermentation.

Die rationelle Auswahl der Nährmedienkomponenten bzw. die Verfahren ihrer Zubereitung und Sterilisation sind ebenso wichtig wie die Auswahl der aktiven Produzenten selbst.

Da die Enzyme Eiweißverbindungen darstellen, muß die Kultivierung ihrer Produzenten auf solchen Nährmedien und bei solchen Temperaturen (Temperaturoptimum) erfolgen, die nicht nur die Synthese des Zelleiweißes an sich, sondern auch die gezielte Synthese eines bestimmten aktiven Eiweißes - des gewünschten Enzyms - gewährleistet. Bei Anwesenheit spezifischer Substrate oder Metabolite im Nährmedien können die Mikroorganismen eine Vielzahl von Enzymen synthesieren.

Zum Wachstum der Mikroorganismen und für die Biosynthese des gewünschten Enzyms muß das Nährmedium Stickstoff- und Kohlenstoffquellen sowie Mineralstoffe (Magnesium, Calcium, Phosphor, Schwefel, Eisen, Kalium, Mangan u. a.) enthalten. Bei einer Produktion im industriellen Maßstab man erstrebt, einheimische und verfügbare billige Materialien (Weizenkleie, Zuckerrübenschnitzel, Malzkeime, Sägespäne, Haferspelzen) sowie Abprodukte der Lebensmittelproduktion und Landwirtschaft einzusetzen.

Bei der Sterilisation der Nährmedien sind die enthaltenen Mikroorganismen und ihre Sporenformen zu vernichten. Es sind folgende Sterilisationsverfahren bekannt: Hitzebehandlung mit Dampf sowie mit heißer Luft; Behandlung mit Hochfrequenzströmen; Ultraschall und IR-Bestrahlung; Behandlung mit ionisierenden Strahlen.

Enzym-Aufarbeitung

Nach der mikrobiellen Produktion eines Enzyms im Fermentationsprozeß ist je nach seiner weiteren Verwertung eine Aufarbeitung erforderlich.

Bei extrazellulären, technischen Enzymen wird die geklärte Kulturlösung häufig nur aufkonzentriert und nach einer Entkeimung durch Filtration getrocknet oder auch als Konzentrat vermarktet. Eine weitere Aufkonzentrierung erfolgt entweder mit Hilfe von Dünnschichtverdampfern oder durch Membrantrenntechniken. Für die Konzentrierung und die Vorreinigung von Enzymen werden auch Hitze- und pH-Behandlungsschritte sowie Fällung mit Neutralsalzen angewendet.

Fällung mit Neutralsalzen: Eine oft angewendete Methode, ein gelöstes Protein durch Zugabe geeigneter neutraler Salze ganz oder teilweise als unlöslichen Niederschlag auszuscheiden. Als Fällungsmittel in wäßriger Lösung werden überwiegend Ammonium- und Natriumsulfat verwendet. Die Wirkung der Neutralsalze beruht darauf, daß durch eine hohe Konzentration die Hydrathülle der Proteinmoleküle vermindert und dadurch ihre Löslichkeit verringert wird. Durch stufenweise Erhöhung der Salzkonzentration ist es möglich, eine fraktionierte Fällung der verschiedenen, im System vorhandenen Proteine zu erreichen. Damit gelingt es auch, Begleitstoffe abzutrennen und die spezifische Aktivität zu erhöhen.

Bei intrazellulären Enzymen greift man zur Methode des Aufschlusses von Mikroorganismen, wodurch das gewünschte Biomolekül nicht geschädigt werden darf. Beim Einsatz von Säuren muß das Molekül säurestabil sein. Ein weiteres Verfahren ist die Plasmolyse, bei der mit hohen NaCl-Konzentrationen aufgeschlossen wird.

Technisch wird meist mit mechanischen Methoden der Zellaufschluß durchgeführt. Bei Kugelmühlen wird eine Zellkulturlösung zusammen mit Glasperlen durch ein hochtouriges Rührwerk in einem Reaktorglas kontinuierlich gemahlen. Bei dem Aufschluß mit Homogenisatoren wird mit Hochdruckpumpen das biologische Material auf einen Druck von ca. 500 bar gebracht und anschließend über Spezialventile entspannt.

Wenn die Enzyme im analytischen oder pharmazeutischen Bereich eingesetzt werden sollen, dann ist eine Feinreinigung durch Chromatographie möglich. Meist werden mehrere chromatographische Methoden nacheinander in einem Verfahren durchgeführt.

Nach dem Trennmechanismus unterscheidet man

a) Gelfiltration - Die Trennung erfolgt nach Molekülgrößen an porösen Trenngelen

b) Adsorptions-Chromotographie - Hydrophile oder hydrophobe Wechselwirkungen (Van-der-Waals-Kräfte) zwischen Träger und biologischem Material werden zur Trennung benutzt

c) Ionenaustausch-Chromatographie - Makromoleküle mit ionischen Gruppen und Ionen werden an entgegengesetzt geladene Träger gebunden

d) Affinitäts-Chromatographie - Gewünschte Enzyme werden absolut spezifisch an einen biospezifischen Stoff gebunden

Zu den letzten Aufarbeitungsschritten gehört die Konfektionierung der Enzyme, die durch eine Sublimations-(Gefrier-)trocknung oder durch eine Fällung oder Kristallisation erreicht werden kann.

Sublimationstrocknung: Die flüssige Phase (in den meisten Fällen Wasser) wird durch Sublimation aus dem gefrorenen Gut unter Umgehung des flüssigen Aggregatzustandes entzogen. Dafür ist ein ständig kontrolliertes Vakuum erforderlich.

Der Markt für technische Enzympräparate

Zur Marktentwicklung nur einige Daten. 1970 wurden weltweit für 40 bis 50 Mio $ Enzyme verkauft; 1977 waren es ca. 180 Mio, 1981/82 mögen es etwa 310 Mio $ gewesen sein,

und 1988 - ca. 1 Mrd DM.