Referat Gentechnische Manipulationsmethoden - Klonieren

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Die Gentechnik hat es sich zur Aufgabe gemacht, Lebewesen aufgrund ihrer Erbinformationen zu verändern. Somit sollen bisher Krankheiten die bisher als unheilbar gelten endlich heilbar werden und auch bei Pflanzen sollen Manipulationen vorgenommen werden die z.B. eine größere Wirtschaftlichkeit erreichen sollen.

Gentechnische Manipulationsmethoden

Klonieren

Die einfachste Methode der genetischen Manipulation ist das Klonen.

Bei den höheren Pflanzen kann man auf sehr einfache Art und Weise ein Kol erzeigen. Schneidet man einfach einen Zweig oder sogar nur ein Blatt einer Pflanze ab und pflanzt dieses in den Boden so kann daraus eine neue Pflanze entstehen. Bei Tieren verhõlt sich das anders, wenn man einem Frosch z.B. einer Heuschrecke ein Bein abschneidet, dann kann man nicht erwarten, das sich daraus ein neuer lebensfõhiger tierischer Organismus entwickelt.

Hierbei werden z.B. Frösche gezüchtet die alle den gleichen Erbbrief besitzen. Dies geschieht indem man den Zellkern einer Eizelle eines Frosches durch den einer Kaulquappe ersetzt. Der enstehende Frosch wird dann genau den selben Erbbrief aufweisen wie die Kaulquappe. Bei wiederholter Durchf³hrung des Experiments an anderen Fröschen mit den Zellkernen aus derselben Kaulquappe entstehen so mehrere Frösche mit identischen Erbinformationen.

Bei Fröschen ist diese Methode noch verhõltnismäßig leicht zu realisieren, da Froscheier relativ groß sind und man mit einer spitzen Pipette den Zellkern mühelos entnehmen kann. Bei Säugetieren jedoch, sind die Eizellen viel kleiner und ihre Entwicklung findet im inneren des K÷rpers statt und somit ist es wesentlich schwieriger hier ein erfolgreiches Kloning durchzuf³hren. Jedoch kann man aus dem weiblichen Körper Eizellen entnehmen, sie im Reagenzglas befruchten und sie dann wieder zurückverpflanzen. Dieser Vorgang wird auch extrakorporale Befruchtung genannt und das Ergebnis dieses Vorgangs kann auch ein menschliches Baby sein. Dies ist dann ein sog. 'Retorten-Baby' . 

Momentan ist die Wissenschaft noch nicht imstande Menschen zu klonen. Was jedoch in einigen Jahren vielleicht möglich ist. Es wäre z.B. denkbar, das ein reicher Fußballvereinsmanager Zellen von verschiedenen Weltstars nimmt und sich dann daraus eine Mannschaft von 11 Superspielern klonen lässt. Doch solche Vorstellungen gelten als abwegig oder sogar als Horror.

Das Klonen ist die einfachste Form der gentechnischen Manipulation. Das eigentliche Ziel der Genetik liegt in der gezielten Manipulation von Erbinformationen.

Bevor man jedoch mit der DNA arbeiten kann, muß man sie zuerst in kleine Bruchstücke zerschneiden, da eine komplette DNA milliarden von Basenpaaren lang sein kann. Zur Trennung der DNA verwendet man Restriktionsendonucleasen, sog. Restriktionsenzyme.

Restriktionsenzyme

Diese Enzyme wurden von dem Schweitzer Arber und von den Amerikanern Smith und Wilson Ende der sechziger Jahre entdeckt. Nun war es möglich , DNA gezielt in kleinere Stücke zu zerschneiden und damit zu experimentieren. Zuvor war das Experimentieren mit DNA noch nicht möglich. Die Restriktionsendonucleasen wurden entdeckt als man bemerkte, das bestimmte Bakterien eindringende Fremd-DNA z.B. Bakteriophagen-DNA in viele kleine Stücke schneiden können und sich somit gegen solche Übergriffe schützen können. Heutzutage sind etwa 500 dieser Enzyme bekannt. Der hauptsächlicher Unterschied zwischen den verschiedenen Restriktionsenzymen liegt in der Art, wie sie die DNA zerschneiden. Manche erzeugen glatte Enden und bei manchen entstehen überstehende Einzelstrang-Enden, da sie die DNA versetzt aufschneiden. Die verschiedenen Restriktionsendonucleasen erkennen verschiedene Nukleotidsequenzen. Diese variieren in Zusammensetzung und Länge. Erkennt ein Enzym z.B. eine bestimmte Folge von 4 Nukleotiden, so sind die entstehenden Fragmente im mittel 256 Basenpaare lang (1/4⁴ = 256 | 1/Anzahl der m. Nukleotide ^Erkennungslänge).

Nach dem die DNA fragmentiert wurde, kann man die DNA-Fragmente mit einem beliebigen anderen Fragment oder gar mit einem anderen DNA-Strang kombinieren. Dies geschieht über die Ligasen. Diese Enzyme wirken wie ein Klebstoff, sie können wei Nucleinsäureketten miteinander verbinden in dem sie die Reaktion zwischen Zucker- und Phospahtresten fördern. Es können aber beim schneiden der DNA durch die verschiedenartige Beschaffenheit der Restriktionsenzyme verschieden lange Enden entstehen. Diese sind aber nur komplementär zueinander, wenn beide mit dem gleichen oder mit einem Restriktionsenzym mit der gleichen Erkennungssequenz gespalten wurden. Wenn dies nicht der Fall ist, so muß mit Hilfe von 'Reperatur-Enzymen' eines der beiden Enden verlängert werden oder die ungepaarten Basen am längeren Ende mit Hilfe einer Exonuklease abgebaut werden. Sind die beiden Enden nicht komplementär obwohl sie die gleiche Länge besitzen, so werden beide Enden komplett abgebaut und es entstehen glatte Enden, gleich denen, die durch einige Restriktionsenzyme entstehen. Diese glatten Enden lassen sich aber nicht so ohne weiteres Verknüpfen. Hierzu wird die sog. Terminale Nukleotid-Transferase benötigt. Sie ergänzt mit Hilfe von Zucker, Phosphatresten und Basen einen Strang um ein Ende. Dabei baut sie gerade die Base ein, die zur Verfügung steht. Man kann diesen Vorgang nun insofern steuern, als daß man zu jedem Strang die Transferase und jeweils eine Basensorte gibt, die zu der Base mit der der andere Strang inkubiert wird komplementär ist. So entstehen z.B. reine Cytosin-Enden , die dann reinen Guanin-Enden gegenüberstehen, und sich somit verbinden können.

Mit Hilfe der Restriktionsendonucleasen ist es den Forschern also möglich DNA in Stücke von bestimmter Länge zu zerschneiden und diese dann aufzutrennen. Sie fungieren quasi wie sehr feine und spezifisch schneidende Skalpelle.

Zwischen der Struktur der DNA zwischen Pro- und Eukaryonten gibt es wesentliche Unterschiede.Während bei Prokaryonten die DNA quasi als fortlaufender Text geschrieben ist, existieren in der Eukaryontischen DNA sogenannte Nonsense-Abschnitte oder besser auch Introns genannt. Die in ihnen enthaltene Basenfolge wird im Gegensatz zu der in den Exons nicht abgelesen. Diese Introns bringt man mit der Evolutionsgeschichte in Zusammenhang und zugleich beweist diese Endeckung, das der Mensch nicht von Bakterien abstammen kann, da deren DNA keine Introns enthält.

Für die Verwendung zur gentechnischen Manipulation ist nur eine RNA zu verwenden. Eine eukaryontische RNA ist nicht für gentechnische Manipulationen zu gebrauchen. Sie muß sich erst einem Vorgang unterziehen, der RNA-Splicing genannt wird. Hierbei werden die Introns aus der RNA herausgeschnitten und man erhält eine RNA die nur noch genetischen Code enthält, der auch tatsächlich abgelesen wird. Die entstandene 'gesplicte' - DNA ist nichts anderes als die bereits bekannte mRNA.

Der Forscher besitzt nun ein spezifisches RNA-Fragment das nur aus Informationen besteht, die die Zelle auch wirklich abließt und verwendet.

Würde er eine Eukaryonten-RNA ohne vorhergegangenes Splicing in einen Prokaryonten implantieren, so würde dieser auch die Introns mit ablesen , da ein Prokaryont keine Introns kennt und somit auch den Vorgang des Splicing nicht beherrscht. Doch mit dem vorliegenden RNA- Stück sind nun Manipulationen von Bakterien und Viren möglich.

Manipulationen von Bakterien

Die Methode des Einfügens von neuer DNA in Bakterien, wurde schon im vorherigen Referat besprochen und wird deshalb hier nicht weiter erläutert. Allgemein sei nur gesagt, daß die Forscher neue DNA in ein Plasmid einer Bakterienzelle einschleußen können, und sie so zum z.B. zum synthetisieren eines neuen Stoffes veranlassen können.

Ein Beispiel : Zuckerrüben enthalten nicht nur den beliebten Zucker , die

Saccharose sondern sie enthalten auch noch Raffinose. Diese

Raffinose stört beim Auskristallisieren des Zuckers. Man

hatte nun in einigen Bakterien Plasmide entdeckt, die sowohl

Saccharose als auch Raffinose abbauen können.

Nun wurde das entsprechende Plasmid mit Hilfe von

Restriktionsendonucleasen auseinandergeschnitten und

so wieder zusammengesetzt, das die Information zum Abbau

von Saccharose fehlte. Nun wurde dieses manipulierte

Plasmid auch in andere Bakterien des gleichen Typs einge-

schleußt. Alle so behandelten Bakterien bauten nun die

Raffinose ab und ließen die Saccharose übrig.

Der genetische Code ist universell, d.h. das prinzipell DNA aus höheren Lebewesen in Bakterien ,unter Berücksichtigung der Introns, integriert werden kann. Jedoch brauch eine DNA aus einem anderen Lebewesen eine Expressions-Vektor um in einem Bakterium so eingebaut zu werden, das sie auch abgelesen wird. Diese Expressions-Vektoren sind Plasmide, die als Transportsystem  für die Fremd-DNA dienen und diese mit dem bakterienspezifischen 'Schalter' versehen, da eine DNA-Sequenz mit einem anderen Schalter als der dem Bakterium zugehörige, nicht abgelesen würde.

Für gentechnisch Manipulierte Bakterien gibt es viele Anwendungsgebiete, sowohl im wirtschaftlichen Bereich als auch im militärischen Bereich.

In der Landwirtschaft könnten Nutzplanzen eingesetzt werden , die z.B. resistent gegen Pestizide ,Umweltgifte und Krankheiten sind und auch unter extremsten Witterungsbedingungen gedeihen oder Pflanzen die aufgrund eines verstärkten Wachstums mehr Ertrag abwerfen. Die große Gefahr bei Freilandversuchenn oder generell bei Versuchen mit genetisch veränderten Organismen ist, das die manipulierte DNA in den Kreislauf der Natur einfließt. Dies kann zum Beispiel passieren, wenn eine gentechnisch manipulierte Ackerpflanze auf einem Versuchsfeld verottet und z.B. ihr Resistenzgen in die Umwelt gelangt und von Bakterien aufgenommen wird. Diese währen dann unter Umständen resistent gegen Antibiotika und damit wesentlich schwerer zu bekämpfen.

Neben solchen Versuchen gab es oder gibt es auch noch z.t. geheime Labors, die meist im Auftrag vom Militär offensive Genforschungen betreiben. In solchen Labors werden gentechnisch veränderte Krankheitserreger produziert sog. B-Waffen. Die internationale B-Waffen Konvention von 1972 erlaubt die Forschung an solchen Waffen sogar ausdrücklich. Hier werden unter Hochsicherheitsvorkehrungen humanpathogene Bakterien und auch Viren gentechnisch Verändert und 'verbessert' d.h. noch gefährlicher gemacht. So werden ihnen z.B. Resistenzgene gegen erschiedenen Antibiotika eingepflanzt

Behandlung von Krankheiten

Zur Behandlung von Krankheiten , die durch einen Gendefekt hervorgerufen werden, muß ein funktionsfähiges Gen in eine Zelle eingefügt werden, bei der dieses Gen aktiv ist. Bei solchen Experimenten werden grundsätzlich keine Veränderungen an Zellen der Keimbahn vorgenommen. Das bedeutet, das die Veränderung mit dem Individuum stirbt.

Wesentliche Vorraussetzung für den Erfolg von solchen Gentherpien ist der selektive Gentransfer. Das gesunde Gen muß in spezifische Zellen gebracht werden, damit es das dortige kranke Gen ersetzten kann. Dazu dienen Viren. Je nach Art des Virus infiziert er nur bestimmte Körperzellen und es lassen sich Fremdgene in seine Erbsubstanz einbauen.

Zum Transport der gewünschten genetischen Information werden sog. rekombinante Retroviren benutzt. Diese Viren koppeln mit der Zellmembran und synthetisieren dann ein Protein das als 'Reverse-Transkriptase' bezeichnet wird. Dieses Protein bewirkt, das die Viren-RNA zu einer Doppelstrang-DNA umgebaut wird.

(G.M.S. S.42)

Danach integriert der Virus sein eigenes Genom + das Fremdgen. Der Lebenszyklus des Virus endet hier, da sein Genom gentechnisch auf ein Minimum reduziert und so konstruiert wurde, das keine Nachkommenviren entstehen können. Somit ist die gewünschte DNA-Sequenz in die Zelle gelangt und kann dort nun verwendet werden. Ein großes Problem ist jedoch die Tatsache, das Retroviren nur Zellen infizieren die noch teilungsaktiv sind. Die meisten hochdifferenzierten Zellen aber, teilen sich nur ncoh selten.

Weitere Möglichkeiten der Gentechnologie

Die Gentechnologie bietet in der Theorie nahezu unbeschränkte Möglichkeiten zur Behandlung von bisher unheilbaren Krankheiten.