Referat Informationen über die HPLC - Aufbau der HPLC-Apparatur

Inhaltsverzeichnis

1. Informationen über die HPLC                                                                               

1.1. Anwendung der HPLC       

1.2. Vergleich der HPLC mit anderen Chromatographie-Verfahren               

2. Allgemeine Informationen zur Chromatographie                                                  

2.1. Chromatographische Trennung bei der HPLC                                          

2.2. Verteilungschromatographie                                                                     

3. Aufbau der HPLC-Apparatur                                                                                

3.1. Lösungsmittel (mobile Phase)                                                                   

3.2. Hochdruckpumpen                                                                                    

3.3. Probenaufgabesysteme        

3.4. Säulen (stationäre Phase)                                                                           

3.5. Detektoren                           

4. Chromatogramme                            

4.1. Qualitative Aussage des Chromatogramms          

4.2. Quantitative Aussage des Chromatogramms        

4.3. Kerngrößen des Chromatogramms                        

4.4. Weitere Information aus dem Chromatogramm    

5. Vorbereitungen für die Messung     

5.1. Mobile Phase                       

5.2. Probenvorbereitung             

5.3. Injektion der Probe              

Ablauf einer Messung mit der HPLC

6.1. Vorbereitung der Maschine 

6.2. Einstellung der Bedingungen                                

6.3. HPLC-Messung                   

6.4. Abschalten der HPLC         

7. Veränderung des Chromatogramms

7.1. Anderung des Elutionsmittel                                

7.2. Temperatureinflüsse            

7.3. Gradientenläufe                   

8. Quellen                                             

1. Informationen über die HPLC:

Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (kurz: HPLC) ist ein Chromato-graphie-Verfahren, das sich in den 60er Jahren aus der Säulenchromatographie entwickelt hat. Bei der HPLC findet die chromatographische Trennung in einer Säule zwischen einer stationären und einer mobilen Phase statt. Die stationäre Phase ist eine Säule, die sehr kleine, poröse Teilchen enthält, und die mobile Phase ist ein Lösungsmittel bzw. -gemisch, welches mit hohem Druck durch die Säule gepreßt wird. Da man mit hohem Druck arbeitet, wird die HPLC auch Hoch-Druck-Flüssigkeits-Chromatographie (High Pressure Liquid Chromatography) genannt.

Diese Chromatographie-Methode liefert eine gute Trennung in kurzer Zeit. Man bekommt trotz des vielen Aufwandes für die Probenvorbereitung ein Chromato-gramm aufgezeigt, über das man eine qualitative und quantitative Aussage machen kann.

1.1. Anwendung der HPLC:

Bei der HPLC können verschiedene Arten der Säulenchromatographie durchgeführt werden. Dazu gehören: Adsorptionschromatographie, Ionenpaarchromatographie, Affinitätschromatographie und Gelchromatographie. Die HPLC hat sich zu einer universell anwendbaren Methode entwickelt. Trotz des relativ hohen apparativen Aufwandes wird die HPLC in Untersuchungs-, Forschungs- und Industrielabors immer mehr eingesetzt. Die HPLC ist in der analytischen, sowie klinischen Chemie als auch in der Biochemie unverzichtbar.

1.2. Vergleich der HPLC mit anderen Chromatographie-Verfahren:

Die Dünnschichtchromatographie (kurz: DC) benötigt eine längere Analysenzeit als die HPLC und die Resultate sind mehr qualitativer als quantitativer Art.

Die Leistungsfähigkeit ist bei der Gaschromatographie (kurz: GC) und der HPLC annähernd die gleiche. Der Unterschied zwischen GC und HPLC besteht in der Anwendbarkeit des Systems und in der Art der mobilen Phase. Für die GC kommen nur Stoffe in Frage, die flüchtig sind bzw. von denen man flüchtige Derivate herstellen kann oder die sich bei höheren Temperaturen unzersetzt verdampfen lassen. Für die Flüssigkeitschromatographie ist die Bedingung, daß sich die Probe in einem Lösungsmittel löst. Dies trifft für fast alle organischen Stoffe, die nicht hochmolekular vernetzt sind, zu.

2. Allgemeine Informationen zur Chromatographie:

Chromatographie ist ein Trennprozeß, bei dem das Probengemisch zwischen zwei Phasen in einer chromatographischen Ebene bzw. Trennsäule verteilt wird. Die stationäre Phase besteht entweder aus einem festen, porösen Material, das aus kleinen Teilchen besteht. Die andere Phase, die mobile Phase, besteht aus einer Flüssigkeit, die über die chromatographische Ebene bzw. Trennsäule strömt.

2.1. Chromatographische Trennung bei der HPLC:

Die Stoffe, die man chromatographisch trennen will, wandern verschieden schnell durch die Säule. Stoffe, die sich bevorzugt in der mobilen Phase aufhalten, wandern schneller durch die Säule als Stoffe, die sich bevorzugt auf der stationären Phase aufhalten.

Nernst'sches Verteilungsgesetz:

Hat ein Stoff die Gelegenheit sich zwischen Phasen physikalisch zu verteilen, so führt diese Verteilung wie bei einer chemischen Reaktion zu einem Gleichgewicht. Das Verhältnis der Konzentrationen eines zwischen zwei Phasen verteilenden Stoffes im Gleichgewichtszustand bei gegebener Temperatur ist konstant. Die Konstante wird Verteilungskoeffizient genannt und hat bei gegebenen Phasen für jeden Stoff einen bestimmten Wert. Das Gesetz ist nur gültig, wenn der Stoff in beiden Phasen denselben Molekularzustand hat.

Als Maß für die Tendenz, sich bevorzugt in der einen oder anderen Phase auf-zuhalten, dient also der Verteilungskoeffizient K oder der Kapazitätsfaktor k':

Diese Bedingungen gelten nur, wenn die stationäre und die mobile Phase im engen Kontakt miteinander stehen, damit sich das Verteilungsgleichgewicht einstellen kann.

2.2. Verteilungschromatographie:

Abbildung 1.a: Start einer chromatographischen Trennung

Das Substanzgemisch, das chromatographisch getrennt werden soll, ist am Anfang der Säule injiziert worden (Abb. 1.a). Es besteht aus den Komponenten D und o.

Damit sich überhaupt ein Stoffgemisch trennt, müssen die verschiedenen Kom-ponenten im betreffenden chromatographischen System verschiedene Verteilungs-koeffizienten und daher verschiedene Kapazitätsfaktoren haben.

Abbildung 1.b: Verteilung zwischen den beiden Phasen

Aus Abbildung 1.b sieht man, daß die Komponenten unterschiedliche k'-Werte besitzen. Die Komponente D hält sich bevorzugt in der stationären Phase auf, die Komponente o hält sich bevorzugt in der mobilen Phase auf. Die Moleküle der Komponenten werden gemäß ihrem Verteilungskoeffizienten von der stationären Phase adsorbiert.

Da neues Fließmittel nachströmt, muß sich ein neues Gleichgewicht einstellen.

Abbildung 1.c: Nachströmen der mobilen Phase und Neueinstellung des Gleichgewichtes

Die Moleküle, die sich in der mobilen Phase befunden haben, sind jetzt über einem neuen, leeren Teil der stationären Phase, und es stellt sich jetzt wieder ein Gleichgewicht nach den jeweiligen Verteilungskoeffizienten ein. Gleichzeitig stellt sich ein Gleichgewicht zwischen den auf der stationären Phase vorhanden Molekülen und der neuen, leeren mobilen Phase ein. Dabei werden Probemoleküle desorbiert. Dieser Vorgang wiederholt sich dauernd.

Abbildung 1.d: Trennung der beiden Komponenten

In Abbildung 1.d sieht man, daß die beiden Komponenten sich getrennt haben und die Komponente o kurz vor dem Verlassen der Säule steht.

3. Aufbau der HPLC-Apparatur:

Zur Grundausstattung der HPLC-Apparatur gehören: Lösemittelvorratsgefäße, Hoch-druckpumpen, Manometer, Injektionsblock, Säule, Detektor und Schreiber.

Abbildung 2: Aufbau einer HPLC-Apparatur

3.1. Lösungsmittel (mobile Phase):

Bei der Chromatographie sollte man die mobile Phase nach bestimmten Eigen-schaften auswählen. Sie sollte in Wechselwirkung mit der geeigneten stationären Phase das Gemisch möglichst schnell trennen. Das Lösungsmittel darf mit der Substanz keine Reaktion eingehen. Die Viskosität der mobilen Phase bestimmt den Druck in der Säule mit. Eine niedrige Viskosität des Lösungsmittel bei einer konstanten Flußrate erzeugt einen niedrigeren Druck als ein höher viskoses Lösungsmittel. Der Siedepunkt des Lösungsmittel sollte nicht zu niedrig liegen, da sonst bei bestimmten Arbeitstemperaturen das Lösungsmittel mit dem hohen Dampfdruck Dampfblasen bildet, die vor allem die Pumpen und den Detektor stören.

Das Lösungsmittel sollte für die UV-Detektoren transparent sein. Beim Brechungs-index-Detektor sollte der Unterschied der Brechungsindizes von Lösungsmittel und Substanz möglichst groß sein.

Die Trennung kann auch mit Lösungsmittelgemischen erfolgen.

Eluotrope Reihe:

Jedes Lösungsmittel eluiert (Elution: Ausspülen oder Austreiben adsorbierter Stoffe aus einem Adsorptionsmittel) die Probemoleküle unterschiedlich schnell. Ein Lösungsmittel, das die Probemoleküle schlecht von den aktiven Stellen der stationären Phase verdrängt, ist ein schwaches Lösungsmittel. Im umgekehrten Fall verdrängt ein starkes Lösungsmittel gut die Probemoleküle von den aktiven Stellen der stationären Phase. Die Stärke bzw. Elutionskraft der verschiedenen Lösungsmittel wurde empirisch ermittelt und in eine Reihenfolge vom schwachen zum starken Lösungsmittel gebracht. Die Reihenfolge nennt man eluotrope Reihe. Dabei zeigt sich, daß die Eluenten nach ihrer Polarität geordnet sind. In der Adsorptionschromatographie ist z.B. Wasser ein starkes Lösungsmittel.

3.2. Hochdruckpumpen:

Die Pumpen werden für die Erzeugung des hohen Druckes in der mobilen Phase gebraucht. Es wird ein hoher Druck benötigt, damit die mobile Phase mit einer annehmbaren Geschwindigkeit (Flußrate) durch die Säule, die durch die feinkörnige Säulenfüllung einen hohen Strömungswiderstand entgegensetzt, fließen kann.

Der Arbeitsdruck hängt von den Meßbedingungen ab. Bei Säulenfüllungen mit der Körnung von ca. 10 mm liegt der Arbeitsdruck in der Regel im Bereich von 35 bis 75 bar. Bei einer Körnung von 3 bis 5 mm steigt der Druck auf 80 bis 200 bar. Weiterhin hängt der Arbeitsdruck von der Flußrate des Eluenten ab. Stellt man eine hohe Flußrate ein, so muß die Pumpe einen hohen Druck erzeugen. Für die Trennung mit höheren Temperaturen, die eher die Ausnahme sind, muß darauf geachtet werden, daß der Druck nicht zu hoch steigt.

Meistens ist das obere Drucklimit der Pumpe zwischen 400 und 600 bar.

Pumpentypen:

Die üblichen Pumpentypen in den neueren HPLC-Maschinen sind Kurzhub-Kolben- und Membranpumpen. Die Kurzhub-Kolbenpumpen fördern weitgehend gleichmäßig und intervallfrei. Bei den Membranpumpen ist eine Durchflußregelung zur gleichmäßigen Förderleistung notwendig.

Membranpumpen:

Eine Exzenterscheibe (Scheibe, deren Drehpunkt außerhalb des Mittelpunkts liegt) treibt einen Kolben rasch hin und her. Die Bewegung des Kolbens wird durch Hydrauliköl auf eine Membran übertragen.

Abbildung 3: Funktion der Membranpumpe

Bei der Vorwärtsbewegung des Kolbens (Abb. 3.3) wird die Membran ausgebuchtet und das Lösungsmittel verdrängt. Bewegt sich der Kolben zurück (Abb. 3.4), so wird Lösungsmittel vom Vorrat angesaugt.

Die Kugelventile geben beim Ansaugen und Ausstoßen der mobilen Phase den richtigen Weg frei.

Da das Ansaugen eine gewisse Zeit braucht, fördert diese Pumpe diskontinuierlich. Die Förderung wird gleichmäßiger, wenn man zwei phasen-verschobene Pumpen arbeiten läßt.

Abbildung 4.a: Diskontinuierliche Förderung                      Abbildung 4.b: Phasenverschobene Förderung

Kurzhub-Kolbenpumpen:

Bei den Kurzhub-Kolbenpumpen verdrängt der Kolben das Lösungsmittel direkt, also ohne Hydraulikflüssigkeit und Membran. Deshalb sind hohe Ansprüche an die Dichtung des Kolbens gestellt. Der Kolben muß gegen mechanische und chemische Korrosion beständig sein. Deshalb besteht der Kolben häufig aus Saphir.

Bei den einfachen Kolbenpumpen, die auch eine kreisförmige Exzenterscheibe besitzen, treten die gleichen Probleme auf, wie bei den Membranpumpen.

Neuere Kolbenpumpen besitzen keine runde, sondern eine nierenförmige Exzenterscheibe ("Cam"), die sich außerdem unregelmäßig schnell dreht.

Abbildung 5: Nierenförmige Exzenterscheibe, "Cam"

In der Position, die man auf der Abbildung 5 sieht, wird der Kolben nach rechts gedrückt und verdrängt das Lösungsmittel. Gelangt der Kolben an Punkt P, so wird der Kolben zwangsläufig, der konkaven Form des Cams folgend, zurückgezogen. Während dieser Phase dreht sich der Cam sehr schnell, so daß der Cam nach 200 Millisekunden wieder bei Punkt P' steht. Die ungleiche Krümmung des Cams bewirkt eine fast konstante Fördermenge (abgesehen von der kurzen Zeit, in der sich der Kolben zurückzieht).

Abbildung 6: Förderung des Cams

3.3. Probenaufgabesysteme:

Bei der Einspritzung ist es wichtig, daß keine Luft in die Säule gelangt. Außerdem sollte die Einspritzung schnell und gleichmäßig erfolgen. Das Probengemisch sollte in die Mitte des Säulenanfangs plaziert werden.

Septum:

Ein Septum ist eine elastische, selbstdichten-de Scheibe aus z.B. Silikongummi, die von einer Nadel durchstochen wird. Das Septum wird nach Art des Lösungsmittels ausgewählt. Septa, die auf der Lösungsmittelseite mit Teflon beschichtet sind, lassen sich universell einsetzen. Die Probelösung wird zunächst in eine Präzisionsspritze aufgenommen. Die Länge der Nadel muß so gewählt werden, daß sie knapp bis zum chromatographischen Bett reicht. Man durchsticht das Septum mit der Nadel und spritzt die Probe ein.

Abbildung 7: Aufbau eines Injektionsblockes

Dosierschlaufe:

Man füllt die Schlaufe mit der Probelösung und dreht dann den Innenkörper mit den Kanälen, um die Schlaufe in den Eluentenstrom zu bringen. Das Elutions-mittel drückt die Probelösung aus der Schleife und befördert die Probe in die Trennsäule. Die Dosierschlaufe ist auswechselbar und man kann ein Dosier-volumen von 1 bis 1000 mL wählen.

Abbildung 8: Dosierschlaufe

3.4. Säulen (stationäre Phase):

Die HPLC-Säulen bestehen gewöhnlich aus austenitischem Chrom-Nickel-Molybdän-Stahl mit Stahlfritten als Säulenverschluß (Austenit: Eisenmischkristall, chem. Eisencarbid). Diese Säulen sind bei dem üblichen Druck in der HPLC beständig und relativ inert gegen chemische Korrosion (wichtigste Ausnahme: Chlorid-Ionen). Für analytische Messungen verwendet man Trennsäulen mit der Länge von 250 mm und 300 mm. Der innere Säulendurchmesser ist bei den meisten Säulen 4 mm und 4,6 mm. Die Säulenfüllung besteht aus porösen Teilchen, welche eine Korngröße von 3 mm, 5 mm, 7 mm oder 10 mm besitzt. Die Korngrößenverteilung, also das Durchmesserverhältnis von kleinsten zum größten Korn, sollte möglichst eng sein und nicht größer als 2 besser 1,5 sein. Je kleiner die Teilchen sind, desto größer ist der benötigte Arbeitsdruck.

Adsorptionschromatographie:

Bei der Adsorptionschromatographie wird Silicagel oder Aluminiumoxid als stationäre Phase verwendet. Auf der Oberfläche sind bei Silicagel die Silanol-gruppen gleichmäßig verteilt. Befindet sich ein Molekül in der Nähe kann eine Art schwache "Bindung" eingegangen werden. Das "Knüpfen" dieser schwachen "Bindung" nennt man Adsorption, das Auflösen derselben Desorption. Die Stärke der Adsorption und damit der k'-Wert steigt von gesättigten Kohlenwasserstoffen zu Carbonsäuren an. Das Lösungsmittel besetzt die aktiven Stellen der stationären Phase mehr oder weniger stark. Das Probemolekül kann also nur adsorbiert werden, wenn seine Wechselwirkung mit den aktiven Stellen stärker ist als die des Lösungsmittels. Die funktionelle Gruppe des Probemoleküls ordnet sich an der Adsorbensoberfläche an, wobei der Alkylrest vom Adsorbens abgewandt ist.

Abbildung 9: Anlagerung des Probemoleküls an den Adsorbens

Da der Adsorbens die Moleküle nicht nach dem aliphatischen Rest trennen kann, ist in der Adsorptionschromatographie ein Gemisch von z.B. Butanol, Pentanol und Octanol schlecht zu trennen.

Reversed-Phase-Chromatographie:

Von der Reversed-Phase-Chromatographie (RPC) spricht man immer, wenn die stationäre Phase wenig polar ist. Am häufigsten wird chemisch gebundenes Octa-decylsilan verwendet. Es sind aber auch C₈- und kürzere Alkylketten im Gebrauch. Bei der RPC wird die Probesubstanz um so stärker an der Oberfläche festgehalten, je unpolarer sie ist.

Ionenpaarchromatographie:

Ionische Proben können auch mit RPC getrennt werden, wenn die Probe nur als eine schwach Säure oder Base vorliegt. Denn diese können durch Einstellen des pH-Wertes in den undissozierten Zustand gebracht werden.

In der Ionenpaarchromatographie wird der mobilen Phase ein organischer ionischer Stoff zugegeben, der die entgegengesetzte Ladung zur Probe-komponente aufweist. Es wird also ein Ionenpaar gebildet, was eigentlich ein Salz ist, aber in seinem chromatographischen Verhalten ein nicht ionisches, organisches Molekül ist.

Affinitätschromatographie:

Die Affinitätschromatographie (Affinität: Neigung von Substanzen miteinander zu reagieren) ist eine chromatographische Methode, bei der die Wechselwirkung zwischen den Probemolekülen und der stationären Phase spezifisch ist. Es gibt zwei Komponenten, die zueinander passen. Die eine Komponente, der Ligand, ist fest an den Träger gebunden. Die andere Komponente, die Probe, wird aus der Lösung adsorbiert. Die Probekomponenten, die nicht zum Liganden passen, werden von der mobilen Phase wegtransportiert. Um die Probe vom Liganden zu desorbieren, muß eine Lösung eluiert werden, welche einen Stoff enthält, der eine größere Affinität zum Liganden besitzt. In einigen Fällen braucht man auch keinen anderen Stoff, sondern ändert nur den pH-Wert.

Gelchromatographie:

Die Gelchromatographie unterscheidet sich grundsätzlich von allen anderen Methoden der Chromatographie. Die Trennung wird nicht durch Wechsel-wirkungen ausgeführt, sondern durch eine einfache Einteilung nach Molekülgröße. Probemoleküle, die zu groß für die Poren in der stationären Phase sind, werden von der mobilen Phase sehr schnell durch die Säule transportiert. Die kleineren Probemoleküle, die in die Poren gelangen, werden verzögert auf dem Detektor erscheinen. Das Lösungsmittel selbst tritt nicht in Wechselwirkungen mit der stationären Phase.

3.5. Detektoren:

Detektoren sind Meßwandler, die das Ausströmen der Komponenten aus der Säule meßbar erfassen und in ein elektrisches Signal umwandeln, das zur Anzeige und Registrierung auf dem Schreiber dienen kann. Der Detektor sollte alle Substanzen möglichst mit gleicher Empfindlichkeit registrieren, gegen Temperaturänderungen weitgehend unempfindlich sein, robust sein und kleine Substanzmengen noch erfassen können. Die am häufigsten verwendeten Detektoren sind UV-Detektoren. Daneben werden noch Brechungsindex-, Leitfähigkeits- und Fluoreszenz-Detektoren verwendet.

UV-Detektoren:

Stoffe, die UV-Licht absorbieren, werden von den UV-Detektoren registriert. UV-Detektoren haben einen weiten Linearitätsbereich und können auch für Gradientenelutionen eingesetzt werden. Sie sind relativ unempfindlich gegenüber Temperaturschwankungen. Die mobile Phase fließt nach dem Verlassen der Säule durch eine Quarzzelle, die die Funktion der Meßzelle erfüllt. Die Meßzelle und eine Referenzzelle, in welcher sich Luft oder Lösungsmittel befindet, werden vom Strahl der gleichen UV-Lichtquelle (Niederdruck-Quecksilberlampe, Deuteriumlampe) durchstrahlt. Um eine Selektivierung bei verschiedenen substanzspezifischen Wellenlängen zu ermöglichen, wird der Lichtquelle ein Monochromator nachgeschaltet. Mit Photowiderständen wird die Lichtintensität des Strahls gemessen. Um eine ordentliche Messung machen zu können, muß vorher eine elektronische Abgleichung zwischen Photowiderstand der Meß- und Referenzzelle beim Durchströmen der reinen mobilen Phase stattfinden. Dabei sollte die mobile Phase bei der Wellenlänge, die die Lampe aussendet, optisch durchlässig sein. Fließt eine Komponente, die das UV-Licht absorbiert, aus der Säule, so ändert sich der Widerstand der Photozelle. Die Anderung des Widerstandes ist abhängig von der Konzentration der Komponente. Die Anderung des Widerstandes ist meßbar, so daß ein entsprechendes Signal an den Schreiber übermittelt werden kann.

Die Nachweisgrenze unter günstigen Bedingungen liegt bei den UV-Detektoren bei ca. 5,0*10^-10 g/mL.

Abbildung 10: Beispiel für die Funktionsweise eines UV-Detektors

Niederdruck-Quecksilberdampflampen:

Niederdruck-Quecksilberdampflampen emittieren hauptsächlich Licht von der Wellenlänge 253,7 nm. Diese Fixwellenlängendetektoren sind bis zu 20mal empfindlicher als Detektoren, welche eine variable Wellenlänge besitzen. Um eine andere Wellenlänge als 254 nm zu erreichen, kann man phosphores-zierende Schichten benutzen.

Deuteriumlampen:

Deuteriumlampen senden ein kontinuierliches UV-Spektrum bis etwa 340 nm aus. Man kann die Wellenlänge der Trennung anpassen. Es wird die Wellenlänge auf das Absorptionsspektrum des interessierenden Stoffes abgestimmt. So ist es manchmal auch durch geeignete Wahl der Wellenlänge möglich, störende Peaks aus dem Chromatogramm verschwinden zu lassen und dadurch eine höhere Genauigkeit für die quantitative Bestimmung zu bekommen.

Wolframlampen:

Wolframlampen emittieren im nahen UV- bis sichtbaren Bereich. Der Wellen-längenbereich liegt zwischen ca. 340 bis 850 nm. Wolframlampen sind also die ideale Ergänzung zu den Deuteriumlampen.

Bei den Deuterium- und Wolframlampen wird das Licht nicht monochromatisch gefiltert, sondern meistens über eine Bandbreite von ca. 10 nm ausgesendet. Bei einer gewählten Wellenlänge von 275 nm umfaßt das einen Bereich von 270 bis 280 nm. Da mehr Lichtintensität zur Verfügung steht, wird die Empfindlichkeit gesteigert. Wird die Bandbreite zu groß gewählt, so wird der lineare Bereich eingeschränkt.

Brechungsindex-Detektoren:

Brechungsindex-Detektoren bzw. RI-Detektoren (refractive index) sind weniger empfindlich als UV-Detektoren. Es lassen sich nur Stoffe detektieren, die einen anderen Brechungsindex haben als die reine mobile Phase. Dazu ist eine gute Thermostatisierung der Zellen notwendig. Bei einem Fresnel-Refraktometer fließt das reine Lösungsmittel durch die Referenzzelle, während durch die Meßzelle die mobile Phase aus der Säule fließt.

Abbildung 11: Funktionsweise des Fresnel-Refraktometers

Bei beiden Zellen wird der Lichtstrahl einer Lampe so gelenkt, daß er auf eine Photozelle trifft, nachdem er das Prisma verlassen hat. Sollte der Strahl aus der Meßzelle durch den Flüssigkeitsstrom der Trennsäule nicht mehr auf eine Photozelle treffen, da sich der Brechungsindex geändert hat, so ändert sich der Widerstand der Photozelle in der Meßzelle. Der Spannungsunterschied der Photowiderstände beider Zellen gibt ein elektrisches Signal an den Schreiber.

Die Nachweisgrenze unter günstigen Bedingungen liegt bei RI-Detektoren bei ca. 5,0 10^-7 g/mL. RI-Detektoren sind also etwa 1000mal weniger empfindlich wie UV-Detektoren.

Leitfähigkeitsdetektoren:

Leitfähigskeitdetektoren werden hauptsächlich in der Ionenchromatographie eingesetzt. Nach dem Durchgang durch die Trennsäule wird jeweils die Leitfähigkeit gemessen. Gibt es eine Anderung der Leitfähigkeit in der mobilen Phase, so wird dieses durch ein elektrisches Signal an den Schreiber weitergegeben.

Fluoreszenz-Detektoren:

Fluoreszenz-Detektoren haben eine große Empfindlichkeit auf fluoreszierende Stoffe. Die Zelle wird mit UV-Licht bestrahlt und das emittierte längerwellige Licht senkrecht zur Einstrahlungsrichtung von Photowiderständen aufgefangen. Es ist darauf zu achten, daß nicht Begleitstoffe, ein ungeeignetes Lösungsmittel oder Sauerstoff in der mobilen Phase die Fluoreszenz löschen.

Detektoren mit Diodenarray:

Ein Detektor mit Diodenarray nimmt ein kontinuierliches UV-Spektrum auf, so daß man über verschiedene Software die beste Wellenlänge auswählt, um einen Stoff zu detektieren.

4. Chromatogramme:

Die getrennten Substanzen werden von der mobilen Phase in den Detektor transportiert und vom Schreiber als Gaußkurven registriert. Die Signale nennt man Peaks und die Gesamtheit aller Peaks nennt man Chromatogramm. Die Peaks liefern bei der HPLC ein qualitatives und ein quantitatives Ergebnis über die zu untersuchende Substanz. Bei gleichgewählten Bedingungen ist die Elutionszeit (Zeit, nach der das Signal geschrieben wird) für jeden Stoff eines Gemisches charakteristisch und die Fläche jedes Signals ist proportional zur Menge des gefundenen Stoffes.

4.1. Qualitative Aussage des Chromatogramms:

Die Retentionszeit einer Komponente ist bei den gleichen chromatographischen Be-dingungen stets gleich groß. Die gleichen chromatographischen Bedingungen sind: Trennsäule, Zusammensetzung der mobilen Phase, Flußrate der mobilen Phase, Temperatur und eventuell Probenvorbereitung.

Wenn man eine unbekannte Substanz hat, kann man zur Identifikation die Retentionszeit zwischen der zu untersuchenden und der in Frage kommenden, reinen Substanz vergleichen.

4.2. Quantitative Aussage des Chromatogramms:

Die Fläche des Peaks ist der eingespritzten Stoffmenge proportional. Wenn man verschiedene Lösungen genau bekannter Konzentration einspritzt, so kann man durch Bestimmung der zugehörigen Peakflächen eine Eichkurve zeichnen. Aus der Peakfläche der unbekannten Probe kann man an Hand der Eichkurve die Konzentration bestimmen.

Linearer Bereich:

Der Nachweis der Konzentration ist auch vom Detektor abhängig. Der ideale Detektor gibt sowohl bei großen wie auch bei minimalen Probemengen ein Signal, dessen Peakfläche der eingespritzten Menge proportional ist.

Abbildung 12: Nachweisgrenzen

Bei realen Detektoren ist die Linearität natürlich nicht unendlich groß. Der lineare Bereich ist bei UV-Detektoren größer als bei Brechungsindex-Detektoren. Er liegt bei den meisten Detektoren in der Größenordnung von 1:10000. Das bedeutet: Ist die untere Grenze des linearen Bereiches z.B. 5,0 10^-8 g/mL, so liegt die obere Grenze bei ca. 5,0 10^-4 g/mL. Innerhalb dieses Bereiches, in der die Linie eine konstante Steigung besitzt, ist es möglich aus der Peakfläche die Konzentration zu bestimmen.

4.3. Kerngrößen des Chromatogramms:

Abbildung 13: Chromatogramm mit eingezeichneten Kerngrößen

Totzeit der Trennsäule t₀:

Die Totzeit der Säule ist die Zeit, die die mobile Phase benötigt, um durch die Trennsäule zu wandern. Für alle Stoffe, die in der Säule getrennt werden, ist die Totzeit gleich. Die Totzeit ist die Aufenthaltszeit der Stoffe in der mobilen Phase. Eine nicht retardierte Substanz, das heißt ein Stoff, der von der stationären Phase nicht festgehalten wird, erscheint also nach der Totzeit t₀ am Säulenende.

Retentionszeit t_R:

Die Retentionszeit ist die Zeit, die vom Einspritzen des Stoffes in die Säule bis zu der Registrierung seines Peakmaximums durch den Detektor vergangen ist.

Nettoretentionszeit t_R':

Die Nettoretentionszeit ist also Differenz aus der Retentionszeit und der Totzeit.

t_R' = t_R - t₀

Die Nettoretentionszeit ist die Zeit, die sich der Stoff auf der stationären Phase aufhält.

Peak-Basisbreite w:

Zur Bestimmung der Basisbreite w zeichnet man in das Chromatogramm die Tangenten der Wendepunkte der Gaußkurve bzw. des Peaks ein. Um die Linie des Schreibers zu berücksichtigen, sollte man die eine Tangente innerhalb der Gaußkurve und die andere außerhalb der Gaußkurve zeichnen.

Abbildung 14: Bestimmung der Basisbreite

Die Basisbreite ist die Strecke, die von den Wendetangenten auf der Nullinie begrenzt wird.

4.4. Weitere Information aus dem Chromatogramm:

Auflösung R:

Die Auflösung R gibt Informationen über die Trennschärfe zweier benachbarter Peaks. Die Auflösung ist der Quotient der Differenz der beiden Retentionszeiten, also der Abstand der Peakmaxima, und dem arithmetischen Mittel aus den beiden Basisbreiten w.

Abbildung 15: Beispiele für die Auflösung

Die Auflösung ist wichtig für die quantitative Bestimmung. Bei einer Auflösung von 1 sind die beiden Peaks noch nicht vollständig getrennt. Bei der Bestimmung der einen Peak-Fläche wird somit ein Stück von der anderen Peak-Fläche hinzuaddiert, so daß man nicht die wirkliche Konzentration berechnen kann.

Eine Auflösung von 1,25 bis 1,5 reicht für die quantitative Bestimmung voll-kommen aus. Höhere Auflösungen kosten nur unnötig viel Zeit.

Berechnung der Auflösung:

Peaksymmetrie T:

Die Peaksymmetrie ist das Verhältnis der Abstände vom Peak zum Maximum in einer ganz bestimmten Höhe. Als Höhe wird oft 10% des Abstandes der Basislinie zum Peakmaximum gewählt

Abbildung 16: Bestimmung der Peaksymmetrie

Die Peaksymmetrie sollte für eine quantitative Bestimmung nicht größer als 2,5 sein, da man sonst den Punkt, wo der Peak die Basislinie erreicht, schlecht erkennt. Eine Gaußform des Peaks kommt zustande, wenn die Peaksymmetrie 1 ist. Sollte sie größer als 1 sein, so spricht man von Tailing, und ist sie kleiner als 1, so spricht man von Fronting.

Berechnung des Kapazitätsfaktors:

Die Totzeit und damit auch die Retentionszeit sind abhängig von der Flußrate der mobilen Phase. Günstiger ist der Kapazitätsfaktor bzw. k'-Wert, der das Molverhältnis der Komponente in den Phase angibt.

Den k'-Wert kann man auch grob aus dem Chromatogramm bestimmen, indem man eine Skala auf die x-Achse des Chromatogramms zeichnet, die einen Abstand von t₀ besitzt. Beim ersten Abstand von t₀ setzt man den k'-Wert auf 0, beim zweimaligen Abstand von t₀ setzt man den k'-Wert auf 1, u.s.w..

5. Vorbereitungen für die Messung:

5.1. Mobile Phase:

Die mobile Phase darf keine Luft enthalten. Unter hohem Druck würden Sauerstoff und andere Gase den Abbau des Elutionsmittels oder der Probe verursachen. Außerdem sinkt die Effizienz der Säule und der Detektor fängt an zu rauschen. Also muß die mobile Phase entgast werden.

Die mobile Phase muß außerdem partikelfrei sein, da es sonst zur Blockierung der Säule kommen kann, was eine große Druckerhöhung nach sich zieht. Deshalb muß die mobile Phase filtriert werden, um sie partikelfrei zu bekommen.

Für die HPLC sind nur Lösungsmittel zu verwenden, die extra für die HPLC ausgewiesen sind.

Das Vorratsgefäß mit der mobilen Phase wird in ein Ultraschallbad gestellt. Bei Lösungsmittelgemischen sollte man mit einem Rührer für ein gute Mischung sorgen. Das Ultraschallbad bleibt solange eingeschaltet bis keine Bläschen mehr aufsteigen. Das erfordert eine Zeit von ca. 5-10 Minuten. Eine weitere Methode zur Entgasung  ist die Verwendung vom vermindertem Druck. Zur Entfernung von Partikeln sollte eine Membranfiltration erfolgen.

5.2. Probenvorbereitung:

Um eine quantitative Aussage machen zu können, muß man vor der Hauptprobe Kalibrierungsproben laufen lassen. Dazu wägt man die zu analysierende Substanz in einen Meßkolben ein und löst sie in einem Lösungsmittel (am besten in dem Elutionsmittel). Die Konzentration sollte im linearen Bereich liegen. Liegt die Konzentration zu hoch, kann man die Lösung verdünnen.

Die Probe wie auch die Kalibrierungsproben werden filtriert, da sonst nach der Injektion die Säule verdreckt sein könnte und damit die Trennleistung verringert wird. Die Probe wird über eine Spritze aufgesogen. Auf die Spritze wird ein Membranfilter gesetzt, der Lösungsmittel beständig sein muß und die zu analysierenden Substanzen nicht adsorbiert. Nun filtriert man die Probe in eine neue Vorlage, aus der die Injektion mit der Injektionsspritze erfolgt.

5.3. Injektion der Probe:

Für eine genaue Messung darf weder die Injektionsspritze noch die Probe verun-reinigt sein. Die Spülung der Spritze sollte bei organischen Lösungsmitteln (als mobile Phase) mit Methanol und bei wäßrigen Lösungsmitteln mit dest. Wasser erfolgen. Die Probe sollte mehrmals mit der Injektionsspritze aufgesogen und herausgelassen werden. Für die Probeneinspritzung dürfen keine Blasen in die Injektionsspritze gelangen. Man saugt mit der Spritze mehr als das doppelte des Volumens der Dosierschlaufe auf. Man dreht die Spritze mit der Nadel nach oben und stellt das doppelte Volumen der Dosierschlaufe ein. Als letztes wischt man die Nadel vorsichtig ab.

6. Ablauf einer Messung mit der HPLC:

6.1. Vorbereitung der Maschine:

Der Computer und die HPLC werden eingeschaltet und die Software wird gestartet. Die Ansaugkapillare wird in das Lösungsmittelvorratsgefäß getaucht, wobei der Lauf-mittelfilter völlig untergetaucht sein sollte. Unter den Laufmittelauslaß wird ein Gefäß aufgestellt, daß mindestens das Volumen des Laufmittels auffangen kann. Um keine Luft durch die Säule zu schicken, muß die Spülkapillare angeschlossen und das Spülventil gegen den Uhrzeigersinn geöffnet werden. Die Druckbegrenzung sollte bei MIN: 0 bar und MAX: 150 bar liegen. Man stellt den Bedienungsmodus der Pumpe auf PURGE und schaltet die Pumpe an. Die Pumpe wird gestoppt, wenn aus der Spülkapillare keine Gasblasen mehr herauskommen. Jetzt kann man das Spül-ventil schließen und die Spülkapillare entfernen.

6.2. Einstellung der Bedingungen:

An der Pumpe wird die Flußrate auf den benötigten Wert und der Bedienungsmodus auf FLOW gestellt. Am UV-Detektor wählt man die Wellenlänge, bei welcher der Stoff detektiert werden soll. Der UV-Detektor braucht für die Deuteriumlampe eine Aufwärmphase von ca. 20 Minuten. Über die Software wird die Methode geladen, die man vorher geschrieben hat, und das Menü für den Datenempfang gewählt. Nachdem bei der Pumpe neue Grenzwerte eingestellt sind, wird sie eingeschaltet und solange gewartet, bis das Signal einigermaßen konstant ist. Jetzt kann man am UV-Detektor AUTO ZERO drücken und das Signal wird auf Null gesetzt. Hat man ein neues Lösungsmittelgemisch sollte man nicht sofort auf die gewünschte Leistung der Pumpe gehen, sondern etwas niedriger bleiben, damit nicht soviel Lösungsmittel gebraucht wird, um die Säule zu konditionieren. Weiterhin sollte man öfters zwischen LOAD und INJECT am Probeneinlaß hin und her schalten, damit Verunreinigungen in diesem weggespült werden. Als letzes muß der Probeneinlaß auf INJECT stehen.

6.3. HPLC-Messung:

Am Computer wird START RUN ausgewählt und mit der Spritze die Probe auf-gesogen. Zur Probenaufgabe wird der Probeneinlaß auf LOAD gestellt und die Spritze in die Vorrichtung eingeführt. Nachdem das Probevolumen injiziert worden ist, wird der Probeneinlaß auf INJECT gestellt und der Computer startet die Messung. Nachdem die Messung fertig ist wird vom Computer die Berechnung des Chromatogramm erstellt und auf dem Drucker ausgedruckt.

6.4. Abschalten der HPLC:

Nach dem man die Analyse beendet hat, sollte man das Elutionsmittel noch ca. 15 Minuten durch die Säule spülen. Hat man Puffersubstanzen verwendet, so sollte man die Säule mit dest. Wasser durchspülen, da sonst eine Auskristallisation der Puffersubstanz in der Säule stattfinden kann. Das Programm wird beendet und der Computer und die HPLC werden ausgeschaltet. Der Lösemittelabfall wird entsorgt und die Injektionsspritze gereinigt.

7. Veränderung des Chromatogramms:

7.1. Anderung des Elutionsmittel:

Wasser, Acetonitril und Methanol sind die gängigsten Lösungsmittel in der HPLC. Wasser wird häufig mit Puffersubstanzen versetzt, um einen bestimmten pH-Wert einzustellen. Das Wasser sollte frei von organischen Rückständen und Keimen sein. Wasser besitzt eine Viskosität von 1,00 mPa*s und hat damit die höchste Viskosität von den drei oben genannten Lösungsmittel. Außerdem hat Wasser die höchste Polarität (vor allem mit Puffersalzen) und damit die geringste Elutionskraft in der RP-Chromatographie. Acetonitril besitzt eine niedrige Viskosität (0,37 mPa s) und wird deshalb gerne als Wasser/Acetonitril-Mischung verwendet. Da organische Lösungs-mittel wie Acetonitril sehr viele Gasblasen bilden, wird durch die Mischung mit Wasser die Gasblasenbildung verringert. Acetonitril besitzt in der RP-Chromato-graphie eine mittlere Elutionskraft. Genauso wie Acetonitril ist auch Methanol giftig. Methanol besitzt als Mischung mit Wasser eine sehr hohe Viskosität, die über der Viskosität von reinen Wasser liegt. Methanol besitzt im Gegensatz zu Acetonitril Protonendonatoreigenschaften.

Nach einem Chromatographie-Lauf mit einem Lösungsmittel mittlerer Elutionskraft, kann man die k'-Werte berechnen. Sollten man kleine k'-Werte besitzen, so kann man mit einem Lösungsmittel bzw. -gemisch eluieren, das eine geringere Elutions-kraft als das vorherige Lösungsmittel besitzt. Ein stärkeres Elutionsmittel ist notwendig, wenn man große k'-Werte hat.

In wenigen Ausnahmefällen kann man tenäre Lösungsmittelgemische verwendet. Dies sind Lösungsmittelgemische, die drei verschiedene Lösungsmittel besitzen. Ein drittes Lösungsmittel wird meistens benutzt, um Substanzen mit bestimmten funktionellen Gruppen schneller zu eluieren oder zu verzögern.

7.2. Temperatureinflüsse:

Durch eine Temperaturerhöhung wird bei den meisten Lösungsmitteln ein Ver-kürzung der Analysenzeit bewirkt. Durch die schnellere Analysenzeit werden die Peaks zwar enger zusammengerückt und die Auflösung sinkt, aber durch die Temperaturerhöhung können verdeckte Peaks erscheinen. Außerdem sinkt die Viskosität bei höheren Temperaturen.

7.3. Gradientenläufe:

Wird während eines Chromatographie-Laufes keine Anderung am chromato-graphischen System vorgenommen, so bezeichnet man dies als isokratischen Lauf. Will man die Analysenzeit beschleunigen, so kann man während des Laufes die chromatographischen Bedingung ändern. Die meisten HPLC-Maschinen werden mit Gradienten ausgerüstet. Es gibt verschiedene Arten von Gradienten: Lösungsmittel-, Durchfluß- und Temperaturgradienten.

Lösungsmittelgradienten:

Bei einem Lösungsmittelgradienten wird die Zusammensetzung des Gemisch während des Chromatographie-Laufes verändert. Werden in einem Chromato-gramm einige Peaks schnell eluiert und andere sehr lange verzögert, kann die Laufzeit über einen Lösungsmittelgradienten verbessert werden ohne die Auflösung wesentlich zu verschlechtern. Man ändert die Zusammensetzung des Lösungsmittelgemisches, nachdem die schnellen eluierten Peaks detektiert worden sind. Die neue Zusammensetzung sollte eine höhere Elutionskraft besitzen, damit die letzten Peaks schneller eluiert werden.

Durchflußgradienten:

Bei einem Durchflußgradienten wird die Flußrate während einer Chromatographie verändert. Wird am Anfang der Chromatographie eine niedrige Flußrate eingestellt, so werden die ersten Peaks in der Auflösung verbessert. Durch eine Erhöhung der Flußrate werden die restlichen Substanzen schneller durch die Säule transportiert.

Temperaturgradienten:

Beim Temperaturgradienten wird während des Laufes die Temperatur verändert. Dabei muß für jeden Lauf die Temperatur gleich schnell steigen, um verwertbar Ergebnisse zu bekommen. Es ist wichtig, nicht nur die Säule, sondern auch die mobile Phase vor der Probenaufgabe zu temperieren.

8. Quellen:

Veronika Meyer

Praxis der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie

Verlag Diesterweg Salle Sauerländer

Jürgen Falbe und Manfred Regitz

Römpp Chemie Lexikon

Georg Thieme Verlag

Gottwald/Puff

Physikalisches-chemisches Praktikum

Verlag VCH

Wollrab

Chromatographie

Aulis Verlag Deubner & Co KG Köln